CryoEM y análisis de estabilidad de virus

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 433 (2023) Citar este artículo

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El virus del moteado plumoso del camote (SPFMV) y el virus del moteado leve del camote (SPMMV) son miembros de los géneros Potyvirus e Ipomovirus, familia Potyviridae, que comparten Ipomoea batatas como huésped común, pero se transmiten, respectivamente, por áfidos y moscas blancas. Los viriones de los miembros de la familia consisten en varillas flexibles con múltiples copias de una proteína de cubierta única (CP) que rodea el genoma de ARN. Aquí informamos la generación de partículas similares a virus (VLP) por expresión transitoria de las CP de SPFMV y SPMMV en presencia de un ARN replicante en Nicotiana benthamiana. El análisis de las VLP purificadas por microscopía crioelectrónica dio estructuras con resoluciones de 2,6 y 3,0 Å, respectivamente, que muestran una disposición helicoidal izquierda similar de 8,8 subunidades CP por vuelta con el extremo C en la superficie interna y un bolsillo de unión para el ssRNA encapsidado. A pesar de su arquitectura similar, los estudios de estabilidad térmica revelan que las VLP de SPMMV son más estables que las de SPFMV.

Potyviridae es la familia más grande de virus de ARN de plantas, conocidos colectivamente como potyvirids, que abarca casi un tercio de todos los virus de plantas conocidos. Se distribuyen por todo el mundo e infectan muchas plantas de importancia agrícola1,2. Actualmente la familia incluye 12 géneros, siendo los miembros del género Potyvirus los más abundantes, con más de 195 especies3. El genoma de la mayoría de los potyvirus consta de un ARN monocatenario de sentido positivo de ~10 kb que codifica una poliproteína grande que da lugar a diferentes productos génicos maduros, denominados del extremo N al extremo C: P1, HCPro, P3, 6K1, CI, 6K2, NIa-VPg, NIa-Pro, NIb y CP. El procesamiento de la poliproteína se basa en la actividad proteolítica de tres proteasas codificadas por virus: P1 y HCPro, que actúa en cis, y NIa-Pro, que actúa tanto en cis como en trans4,5. Además, los genomas de todos los miembros de la familia codifican un producto del gen P3N-PIPO parcialmente fuera de marco, que se traduce a partir de variantes del genoma con nucleótidos adicionales generados después de un mecanismo de deslizamiento de la polimerasa que ocurre en un motivo de nucleótido G2A6 conservado6,7, 8. Un mecanismo equivalente también sirve para producir P1N-PISPO en ciertos potyvirus que infectan plantas de boniato (Ipomoea batatas)9,10. La organización del genoma es compartida de manera similar por los miembros de los géneros adicionales de la familia, con algunas divergencias, principalmente mapeadas en la región 5'11.

Una característica común para todos los potyvirids es la estructura de los viriones como partículas flexibles en forma de varilla sin envoltura, compuestas de múltiples copias de una proteína de cubierta única (CP) dispuestas helicoidalmente alrededor del genoma de ARN12,13. Los viriones juegan un papel esencial en el ciclo de replicación del virus y especialmente durante el proceso de transmisión. Los potyvirus son transmitidos por áfidos vectores de forma no persistente con la participación de CP y HCPro14,15,16,17, mientras que otros géneros dentro de la familia incluyen virus agrupados por características biológicas distintivas, principalmente los diferentes vectores utilizados para la transmisión, tales como los ipomovirus18 transmitidos por mosca blanca, que son comparativamente menos estudiados en su transmisión. La clasificación en géneros también tiene en cuenta otras peculiaridades en la estructura del genoma y las relaciones filogenéticas. Los estudios evolutivos han sugerido que la expansión de las especies de potyvirus podría haber coincidido aproximadamente con los albores de la agricultura, una noción que se ve respaldada por su capacidad colectiva para infectar una amplia gama de huéspedes y su presencia global19,20.

Se han determinado estructuras de viriones para varios potyvirus, aunque solo tres de ellos, el virus del mosaico de la sandía (WMV), el virus del mosaico del nabo (TuMV) y el virus Y de la patata (PVY), han sido resueltos por CryoEM21,22,23. Por el contrario, se han estudiado relativamente pocos miembros de otros géneros dentro de la familia24,25 y se desconocen las estructuras de los viriones de algunos géneros, incluidos los ipomovirus. Para comparar las estructuras de virión de virus pertenecientes a diferentes géneros, seleccionamos el potyvirus Sweet Potato Feathery Mottle Virus (SPFMV) y el ipomovirus Sweet Potato Mild Mottle Virus (SPMMV) ya que estos infectan naturalmente la misma planta huésped, la batata. Ambos son patógenos importantes: el SPFMV se considera el patógeno viral más prevalente de la batata en todo el mundo, y aunque a menudo no es particularmente dañino como una sola infección, puede ser bastante grave en las coinfecciones con el virus del enanismo clorótico de la batata (SPCSV, género Crinivirus, familia Closteroviridae), lo que lleva a pérdidas de rendimiento dramáticamente altas de hasta el 80%26,27. De manera similar, SPMMV28 puede infectar el mismo cultivo y también causar pérdidas significativas de rendimiento en infecciones mixtas con otros virus como SPCSV29,30.

Como se mencionó anteriormente, estos dos virus pertenecen a géneros que incluyen miembros transmitidos por diferentes insectos vectores homópteros: pulgones en el caso de los potyvirus y moscas blancas en el caso de los ipomovirus. El mecanismo de transmisión del pulgón en potyvirus ha sido ampliamente estudiado, incluyendo la caracterización de HCPro como factor auxiliar esencial del proceso junto con el CP16. Por el contrario, para los ipomovirus hay poca información sobre el papel de los viriones en la especificidad del vector, ni sobre la posible dependencia de los factores auxiliares de transmisión. Curiosamente, la región HCPro está ausente en los ipomovirus, excepto en SPMMV, que tienen P1s31,32 únicos o duplicados. Si bien HCPro es el supresor canónico de silenciamiento de ARN (RSS) en la mayoría de los potyvirus33,34, esta función parece estar desplazada a P1 en los ipomovirus35, e incluso en el caso de SPMMV donde está presente HCPro, se demostró que P1 es el producto que actúa como un RSS36. Asimismo, en SPFMV existe HCPro como en el resto de potyvirus, pero la función RSS se asoció a P1N-PISPO9,10.

La purificación de viriones de plantas susceptibles infectadas a menudo da como resultado bajos rendimientos, lo que dificulta los estudios estructurales. En algunos casos, la acumulación puede ser mayor en huéspedes experimentales en comparación con los huéspedes naturales. Aunque el SPMMV puede infectar a varios huéspedes experimentales, en particular N. benthamiana y N. tabacum, que son bastante adecuados para la purificación de viriones, este no es el caso del SPFMV, un virus con un rango de huéspedes bastante estrecho. Esto ha dificultado la comparación directa de los viriones de los dos virus. Además, SPFMV siempre muestra una acumulación muy baja en infecciones únicas de plantas de batata, y el aumento de la acumulación en infecciones mixtas con SPCSV impide la preparación de viriones puros, porque tanto el potyvirus como el crinivirus tienen partículas flexibles alargadas que probablemente muy difícil de separar. Para resolver todos estos problemas y permitir los estudios estructurales, hemos aprovechado las similitudes entre los viriones y las partículas similares a virus (VLP) para utilizar una metodología recientemente descrita para la producción de VLP helicoidales, basada en la expresión de CP virales a partir de una replicación viral heteróloga. ARN que también se incorpora a las VLP. Se ha demostrado que este enfoque es muy eficaz para producir VLP que se asemejan mucho a la estructura del virus original37. Usando esta estrategia, las VLP flexibles alargadas de SPFMV y SPMMV se produjeron de manera eficiente en la planta, lo que nos permitió purificarlas en cantidades suficientes para el análisis estructural para probar la hipótesis de que ciertas diferencias podrían servir para explicar sus peculiaridades biológicas y especificidad de vector. Aquí presentamos las estructuras CryoEM de alta resolución de SPFMV y SPMMV, dos virus que infectan al mismo huésped natural, la batata, pero que pertenecen a dos géneros diferentes, Potyvirus e Ipomovirus, dentro de la familia Potyviridae. Esto ha permitido una comparación de sus propiedades estructurales con el objetivo de obtener información sobre sus diferentes modos de transmisión.

Las construcciones pEff-SPFMV-CP y pEff-SPFMV-CP, diseñadas para expresar las CP de SPFMV y SPMMV (Fig. 1a), se agroinfiltraron en plantas de N. benthamiana. En un trabajo anterior37, se utilizó una secuencia de CP diferente correspondiente a otro aislado de SPFMV (GeneBank: NC001841) para probar la versatilidad del sistema de expresión basado en pEff para diferentes VLP. Para ese trabajo, la secuencia de CP fue sintetizada por un proveedor comercial, pero en el presente trabajo optamos por construir una nueva versión de pEff-SPFMV-CP que amplifica el gen de CP de un aislado que infecta plantas (GeneBank: KU511268), con el fin de permitir comparaciones entre VLP y viriones.

a Mapas esquemáticos de construcciones basadas en pEff con el ARNm subgenómico generado por el promotor subgenómico (SGP) en el casete del replicón PVX después de la ARN polimerasa dependiente de ARN viral (RdRp). Un casete separado contiene el supresor de silenciamiento de ARN P24 de GLRaV-2, ambos bajo el control de las señales del promotor (35S) y del terminador (NOS). Ambas partes están flanqueadas por los bordes derecho e izquierdo RB y LB necesarios para la transferencia del T-DNA a la planta. b Análisis de Western blot de la expresión de SPFMV CP (35 kDa, flecha) a los 3, 5 y 7 días post agroinfiltración, utilizando un anticuerpo policlonal específico. c Análisis de Western blot de la expresión de SPMMV CP (34 kDa, flecha) a los 3, 5 y 7 días después de la agroinfiltración, utilizando un anticuerpo policlonal específico. Tanto en byc, las muestras infiltradas con el vector vacío pEff se incluyeron como controles negativos, y los paneles a continuación muestran la tinción Ponceau S correspondiente de la subunidad grande (53 kDa) de la proteína Rubisco como control de carga. d Imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de una partícula ensamblada en extracto crudo clarificado de tejido vegetal infiltrado con pEff-SPFMV-CP, capturada con un Talos F200C TEM equipado con una cámara Gatan OneView. La barra corresponde a 200 nm. e Imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de una partícula ensamblada en extracto crudo clarificado de tejido vegetal infiltrado con pEff-SPMMV-CP, capturada en un microscopio JEM-1400. La barra corresponde a 200 nm.

El efecto de las construcciones basadas en pEff en los tejidos agroinfiltrados fue consistente con las observaciones previas37. En nuestras condiciones, pEff-SPMMV-CP pareció afectar el tejido de manera menos severa que pEff-SPFMV-CP, lo que en algunos casos resultó en necrosis en puntos de tiempo tardíos> 7 días después de la agroinfiltración (dpa).

La acumulación de CP se determinó mediante SDS-PAGE y análisis de transferencia Western en extractos de proteínas totales de tejido vegetal agroinfiltrado a los 3, 5 y 7 dpa. Nuestros resultados mostraron que tanto los CP SPFMV como los SPMMV se detectaron como productos con sus tamaños esperados (Fig. 1b, c). Este resultado fue consistente en el caso de SPFMV con los reportados previamente37. Comparativamente, la cantidad de SPMMV-CP producida fue similar para los tres puntos de tiempo analizados, pero SPFMV-CP pareció acumularse más en los últimos tiempos después de la infiltración, coincidiendo aproximadamente con la respuesta de necrosis observada. Inesperadamente, los anticuerpos policlonales permitieron la detección cruzada de los dos CP, a pesar de que la identidad de aminoácidos entre ellos era solo moderada (29 % según la comparación BLAST), lo que sugiere que algunos epítopos podrían ser comunes para los dos virus en tramos de similitud local que pueden ser identificados. identificado en la alineación de las dos secuencias (Fig. 1 complementaria). El análisis TEM de muestras teñidas negativamente reveló la presencia de VLP para ambos virus (Fig. 1d, e), lo que confirma que el sistema pEff proporcionó una plataforma eficiente para la producción de VLP de potyvirid.

Para SPFMV, varios protocolos publicados anteriormente para la purificación de viriones de SPFMV38,39,40 demostraron ser inadecuados o dieron como resultado bajos rendimientos (calculados como mg por g de peso fresco de tejido) cuando se aplicaron a las VLP. A pesar de las amplias modificaciones destinadas a mejorar los métodos, los rendimientos se mantuvieron en torno a 0,04 mg/g. Sin embargo, optamos por utilizar un procedimiento modificado basado en el protocolo de Nakashima y colaboradores40, comenzando con más material vegetal para compensar el bajo rendimiento. Después de la separación de la muestra en gradientes de densidad de sacarosa y el análisis por SDS-PAGE, varias fracciones mostraron una proteína principal de alrededor de 35 kDa como el tamaño esperado para CP (Fig. 2a). El análisis TEM de estas fracciones mostró la presencia de filamentos flexibles de VLP con un diámetro de 12-15 nm, pero con longitudes más cortas que las esperadas según Moyer & Kennedy38 para viriones nativos (alrededor de 850 nm). Nuestras VLP midieron en el rango de 60 a 700 nm (promedio de 262 nm), con los tamaños más abundantes en categorías de alrededor de 200 a 250 nm y un pico secundario adicional de aproximadamente 400 nm (Fig. 2b y Fig. 2 complementaria).

una SDS-PAGE de muestras correspondientes a fracciones de gradiente de sacarosa (40–10 %, carriles 1–7) de SPFMV-VLP purificadas. Se detecta una sola banda de ~35 kDa con el tamaño esperado de SPFMV-CP, y solo en las fracciones 6 y 7 con una banda adicional (50 kDa) que probablemente sea la subunidad grande de Rubisco. b Análisis TEM de la fracción 5. La barra de escala corresponde a 1 µm. c SDS-PAGE de muestras correspondientes a fracciones de gradiente de sacarosa (40–10 %, carriles 1–6) de SPMMV-VLP purificadas, mostrando una banda prominente que coincide con el tamaño de SPMMV-CP (34 kDa, mientras que la banda más corta alrededor de 30 kDa probablemente sea una forma truncada). En la fracción 6, hay una banda adicional (50 kDa, probablemente la subunidad grande de Rubisco). d Análisis TEM de la fracción 4. La barra de escala corresponde a 200 nm. e Tinción con azul de metileno (izquierda) y análisis de transferencia Northern (derecha) de muestras de ARN extraídas de SPFMV-VLP purificadas (carril 2), tejido vegetal de N. benthamiana agroinfiltrado con el vector pEff correspondiente (carril 3) y tejido de una planta simulada (carril 4). La transferencia Northern se incubó con una sonda específica de SPFMV-CP. Un producto de PCR correspondiente a la región utilizada para la sonda se incluyó como control para la hibridación (carril 1), y las movilidades de los rRNA 28S y 18S, correspondientes respectivamente a 4000 y 1600 nts, se indican como marcadores de tamaño interno. La punta de flecha indica el ARN principal que se encuentra en las VLP. f Tinción con azul de metileno (izquierda) y análisis de transferencia Northern (derecha) de muestras de ARN extraídas de SPMMV-VLP purificadas (carril 2), tejido vegetal agroinfiltrado con el vector pEff correspondiente (carril 3) y tejido de una planta simulada (carril 4 ). La transferencia Northern se incubó con una sonda específica de SPMMV-CP. Un producto de PCR correspondiente a la región utilizada para la sonda se incluyó como control para la hibridación (carril 1), y las movilidades de los rRNA 28S y 18S, correspondientes respectivamente a 4000 y 1600 nts, se indican como marcadores de tamaño interno. La punta de flecha indica el ARN principal que se encuentra en las VLP.

La purificación de las VLP de SPMMV se logró con menos dificultades siguiendo un procedimiento publicado para la purificación de viriones en tampón fosfato28, alcanzando rendimientos de alrededor de 0,35 mg/g de peso fresco de tejido. Después del fraccionamiento en gradientes de sacarosa, se observaron dos productos de alrededor de 34 y 30 kDa en el análisis SDS-PAGE. Los dos productos fueron reconocidos por anticuerpos CP, lo que sugiere que podrían corresponder al CP de longitud completa y un producto parcialmente degradado (Fig. 2c y Fig. 3 complementaria). En EM de tinción negativa, se observaron VLP con una estructura similar a los viriones como filamentos flexuosos de 12-15 nm de diámetro y longitudes que oscilan entre 60 y 550 nm (promedio de 250 nm), con los tamaños más abundantes nuevamente en categorías alrededor de 200- 250 nm y 400–450 nm (Fig. 2d y Fig. 2 complementaria).

El trabajo anterior mostró que las VLP de virgavirus y potexvirus generadas por pEff contienen ARN derivados de la replicación del vector, lo que refuerza la idea de que un andamio de ARN era importante para la formación de partículas helicoidales37,41. Para evaluar si esto también se aplica a las VLP de potyvirid producidas por pEff, analizamos ambos tipos de VLP de SPFMV y SPMMV purificadas. El ARN se extrajo de las preparaciones de VLP, se sometió a electroforesis, se transfirió a membranas y se hibridó con sondas específicas42. Para confirmar la especificidad, las sondas también se probaron en combinaciones heterólogas, encontrando que cada sonda hibridaba solo con los ARN presentes en las VLP homólogas correspondientes, mientras que no se observaron señales de hibridación en los carriles de control correspondientes al ARN derivado del tejido infiltrado con el vector pEff vacío o un vector pEff vacío. planta simulada de N. benthamiana, (Fig. 2e, f) donde la tinción con azul de metileno reveló bandas de ARN correspondientes a los ARN ribosómicos derivados de plantas esperados. El tamaño estimado de los componentes de ARN mayoritarios en muestras de VLP de SPFMV y SPMMV fue superior a 1000 nucleótidos, lo que probablemente corresponda a los ARN subgenómicos dedicados a la expresión de genes CP, lo que confirma la alta actividad esperada del promotor subgenómico correspondiente. Para evaluar si otros ARN observados en las VLP se originaron a partir de los vectores de replicación, también se probó una sonda contra el gen de la replicasa PVX para detectar específicamente el ARNm derivado de pEff. Esto confirmó que las VLP de potyvirid derivadas de pEff contenían ARN que se origina a partir de la replicación del vector pEff (Fig. 4 complementaria).

Con respecto a los tamaños de los ARN encapsidados, se esperaba que los ARN más abundantes correspondieran a los componentes subgenómicos que expresan CP, calculados en > 1100 nucleótidos tanto para SPFMV-CP como para SPMMV-CP, mientras que los ARNm completos derivados de pEff eran > 5600 nucleótidos. Teniendo en cuenta los tamaños proporcionales en comparación con los viriones, los tamaños esperados de las VLP serían alrededor de 100 nm para los sgRNA y 470 nm para los mRNA de replicación de tamaño completo. Estos dos tamaños eran compatibles con nuestras mediciones de VLP, aunque la distribución no se ajustaba exactamente a una curva bimodal (ver nuevamente la Fig. 2 complementaria).

Se empleó fluorimetría de barrido diferencial para evaluar la estabilidad térmica de las VLP, usando Sypro Orange como un fluoróforo extrínseco que interactúa con los residuos hidrofóbicos expuestos43,44. Se determinaron dos cambios de temperatura para cada tipo de VLP (Fig. 3a, b), consistentes con dos transiciones, que probablemente corresponden a la primera a la disociación de la VLP en sus monómeros CP constituyentes (Tm1), y la segunda al despliegue de la Subunidades CP (Tm2). La señal de fluorescencia obtenida para SPFMV-VLP fue significativamente menor que para SPMMV-VLP, lo que indica diferentes interacciones entre el fluoróforo y la VLP/CP para cada sistema. Las temperaturas de transición se calcularon después de la normalización de datos utilizando la primera derivada de una fracción nativa para cada muestra (Fig. 3c), y los resultados mostraron que las SPFMV-VLP se disociaron a 55 °C (Tm1), mientras que las unidades CP se desdoblaron a 66 ° C (Tm2), mientras que las SPMMV-VLP se disociaron a 60 °C (Tm1), con desdoblamiento de las unidades CP a 69 °C (Tm2). En conjunto, estos valores demostraron además que las VLP de ipomovirus exhibieron una estabilidad medible más alta en comparación con las VLP de potyvirus.

un análisis de fluorimetría de barrido diferencial que revela 2 cambios de temperatura para SPFMV-VLP. b Análisis de fluorimetría de barrido diferencial que revela 2 cambios de temperatura para SPMMV-VLP. c Representación gráfica de primera derivada de las temperaturas de fusión para los dos tipos de VLP, después de la normalización de datos. Para cada tipo de VLP, el primer cambio de temperatura (Tm1) explica la disociación oligomérica de la partícula, mientras que el segundo (Tm2) representa muy probablemente el desarrollo de las CP.

Las estructuras de SPFMV y SPMMV se determinaron utilizando cryoEM de partícula única con simetría helicoidal, con resoluciones de 2,6 Å (SPFMV) y 3,0 Å (SPMMV) (Fig. 4 y Tabla 1). La arquitectura general de las VLP de SPFMV y SPMMV fue similar a la determinada para otros virus filamentosos flexuosos de plantas21,22,23. Ambas estructuras forman una disposición helicoidal levógira, formada por unas 8,8 subunidades por vuelta con un diámetro de 130 Å. Cada subunidad está separada por elevaciones helicoidales de 3,97 Å y 3,98 Å y giros helicoidales de 41,2° y 40,83°, respectivamente, para SPFMV y SPMMV. Comparando las dos estructuras en general, la organización helicoidal es relativamente similar. Son evidentes pequeñas variaciones dentro de los tres dominios de las proteínas de cubierta individuales.

a Organización esquemática de las VLP de SPFMV y SPMMV, codificadas por colores según los tres dominios y el número de residuos indicados para las secuencias de proteínas de cubierta correspondientes. b Mapas CryoEM para los VLP indicados de SPFMV y SPMMV. Los mapas están coloreados según los tres dominios en la proteína de cubierta única utilizada en (a) con una de las proteínas de cubierta en ambas estructuras coloreada en cian. Ambos paneles muestran los mapas cryoEM en vista lateral (izquierda), vista recortada (centro) y vista superior (derecha). El ssRNA está coloreado en rojo y los diámetros exterior e interior están etiquetados. c Se muestran modelos estructurales ajustados al mapa CryoEM para proteínas de cubierta individuales de SPFMV (izquierda) y SPMMV (derecha), etiquetados con regiones de proteína de cubierta.

Los mapas cryoEM de los virus de la batata permitieron construir un modelo atómico para la mayor parte de la secuencia de la proteína de la cubierta. Debido a la naturaleza flexible de los extremos N y C, partes de estos segmentos carecían de resolución suficiente para modelar la secuencia precisa, pero se modelaron como polialanina dondequiera que se pudiera rastrear el esqueleto polipeptídico. Las proteínas de cubierta de ambas estructuras contienen tres dominios; un dominio N-terminal formado por residuos 1–123 (SPFMV), 1–111 (SPMMV), un dominio central con residuos 124–276 (SPFMV), 112–262 (SPMMV) y una cola C-terminal que comprende 277– 316 (SPFMV), 263–305 (SPMMV) residuos. La densidad cryoEM permitió modelar los residuos 91–310 (SPFMV) y 66–296 (SPMMV), identificando los componentes principales de los tres dominios en cada estructura de CP. El dominio central consta de nueve hélices α (SPFMV) y dos cadenas β, una característica que parece estar conservada entre otros virus de la familia Potyviridae. Un bolsillo de unión al ARN está situado en una grieta formada por el dominio central y la cola C-terminal. El extremo C del filamento forma una disposición en espiral, lo que da como resultado la formación de un tubo interno de densidad, formado por el extremo extremo C de los CP.

En ambas estructuras, las subunidades están dispuestas para formar una forma de tornillo helicoidal que forma la cápside. La porción N-terminal de cada CP se conecta a la subunidad adyacente alrededor del tornillo helicoidal, así como a las subunidades en la siguiente capa "hacia abajo" (Fig. 5). De manera similar a las otras estructuras de Potyviridae, el extremo N da un giro de 90° después de conectarse a la subunidad adyacente para mantener la subunidad hacia abajo mediante una serie de interacciones. Esta disposición es sorprendentemente diferente a las estructuras de Alphaflexiviridae donde cada terminal N de CP solo conecta la subunidad adyacente45. Una serie de enlaces de hidrógeno y puentes salinos en ambas estructuras mantienen juntas las subunidades (Fig. 5; Tablas complementarias 1, 2).

un mapa CryoEM de SPFMV coloreado según la elevación de la subunidad a lo largo de un giro helicoidal (subunidad inicial en cian y subunidad 10 en azul oscuro). El panel derecho muestra el modelo estructural correspondiente de un segmento completo con las subunidades primera, segunda y décima etiquetadas. b Mapa CryoEM de SPFMV (panel superior) coloreado según los extremos N del primer CP (en púrpura), N + 1 (en cian) y N + 10 CP (en azul oscuro) a lo largo del segmento helicoidal. Los tres CP están coloreados en rosa con el extremo C en naranja. El panel inferior muestra el mapa cryoEM de SPMMV, coloreado según los extremos N del primer CP (en dorado), N + 1 (en cian) y N + 10 (en azul oscuro). Los paneles centrales muestran una vista de primer plano de la organización N-terminal entre Nth, N + 1 y N + 10 CP en las estructuras SPFMV y SPMMV. Los paneles de la derecha muestran el área delineada y ampliada para la interacción N-terminal con Nth CP a través de N + 1 (cian) y N + 10 (azul oscuro) N-terminal en SPFMV (arriba a la derecha) y SPMMV (abajo a la derecha) respectivamente. Los residuos clave están etiquetados con el N-ésimo CP que se muestra como un mapa filtrado gaussiano para ilustrar los bolsillos de unión, modelo N + 1 en rosa (SPFMV) y en naranja (SPMMV), con sus segmentos N-terminal en cian y el N + 10 N-terminal segmentos mostrados en azul oscuro.

La arquitectura del brazo N-terminal, así como el modo de interacción, se conservan entre las dos estructuras, observándose variaciones locales en función de las secuencias. Por ejemplo, la hélice α 1, cuyas ranuras en la grieta de la subunidad adyacente están inclinadas hacia abajo en SPMMV, en comparación con las regiones N-terminales de SPFMV y PVY (Fig. 5 complementaria), con una desviación cuadrática media (RMSD) de 4,7 Å. En general, el alto grado de similitud entre las proteínas de la cubierta de los dos virus sugiere un modo común de interacción entre las CP durante el ensamblaje de la cápside.

Con el fin de modelar las regiones terminales N y C extremas, no suficientemente bien resueltas en las estructuras crioEM debido a la señal débil que resulta de promediar diferentes conformaciones, se realizó una predicción de estructura basada en secuencias para los dos virus utilizando AlphaFold (Supplementary Figura 6). Los modelos predichos con mejor puntaje recapitularon las estructuras cryoEM del CP con un alto grado de similitud en los dominios centrales. Curiosamente, la estructura predicha para SPFMV CP mostró un extremo N en gran parte no estructurado, respaldado por el alto factor b en esta región y sugirió una precisión reducida en la predicción en esta región. Por otro lado, la estructura predicha para SPMMV CP mostró un bucle flanqueante seguido de un motivo de hélice-giro en el extremo N, no observado en la estructura cryoEM. Teniendo en cuenta la alta puntuación de confianza en esta región de la estructura predicha AlphaFold, es probable que este motivo estructural se promedia durante la reconstrucción 3D cryoEM debido a la posible alta flexibilidad del bucle N-terminal que lo precede.

En las estructuras CryoEM de alta resolución para SPFMV y SPFMV, se observaron cinco nucleótidos del ssRNA encapsidado en los bolsillos de unión de las proteínas de cubierta individuales. La resolución de los mapas fue suficiente para construir la cadena de ARN de cinco nucleótidos de novo con nucleótidos de uridina. La secuencia exacta de ARN es difícil de discernir ya que las densidades del ARN observado son el resultado de los segmentos promediados de las diferentes partes del filamento del virus. Ambas estructuras muestran el ARN que abarca una longitud de 23 Å, que corresponde a una parte importante del dominio del núcleo interno de las proteínas de la cubierta, así como una conformación similar con un RMSD de 0,7 Å.

Los segmentos de ARN están unidos a un bolsillo de unión de ARN interno, formado por residuos del dominio central y el segmento C-terminal de la proteína de cubierta (Fig. 6). Este es un bolsillo en gran parte cargado formado por argininas y lisinas que se unen e interactúan con la columna vertebral de ARN cargada negativamente, además de formar una serie de enlaces de hidrógeno (Fig. 6; Tabla complementaria 3). Al igual que en otras estructuras de Potyviridae, se encuentran conservados tres residuos (Arg, Ser, Asp) en este bolsillo de unión que se cree que son importantes en el empaquetamiento correcto del ARN durante el ensamblaje viral, como se muestra también en el caso del potexvirus PepMV21, 46. En las estructuras del virus del camote, estos corresponden a Arg 235, Ser 172 y Asp 248 (SPFMV), y Arg 262, Ser 152 y Asp 236 (SPMMV) respectivamente (Fig. 6). Otra característica conservada observada en las dos estructuras del virus de la batata es que el cuarto nucleótido del ARN tiene su base de nucleótidos mirando hacia adentro, hacia el bolsillo. Esta parece ser una característica común observada en otras estructuras de Potyviridae y Alphaflexiviridae, lo que sugiere la importancia de esta interacción dentro del bolsillo de unión de ARN entre los virus de plantas (Tabla complementaria 3). Juntos, el efecto acumulativo de las interacciones en el bolsillo de unión del ARN del dominio central del CP protege al ARN del daño.

a El panel izquierdo muestra el modelo atómico ajustado de SPFMV CP, coloreado de N- (azul) a C-terminal (rojo) con las densidades cryoEM mostradas en gris. Un panel ampliado muestra la cavidad de unión al ARN ubicada dentro del dominio central; Modelo SPFMV mostrado en rosa con nucleótidos de ARN U1 a U5 en rojo. Los paneles superior derecho e inferior derecho muestran el sitio de unión del ARN en SPFMV y SPMMV respectivamente, con coordenadas atómicas ajustadas para ssRNA (en rojo) dentro del mapa cryoEM (mostrado en gris). Los residuos de interacción clave están etiquetados. b El panel izquierdo muestra las estructuras alineadas de ssRNA de SPFMV (en rosa) y SPMMV (en dorado) con nucleótidos marcados. El panel derecho muestra los mapas de potencial electrostático de superficie computados para CP, vistos a lo largo de los bolsillos de unión de ARN, con el ssRNA mostrado como un modelo atómico en cian. La coloración varía entre puntos cargados positivamente (azul), neutros (blanco) y puntos cargados negativamente (rojo).

El impacto económico de las enfermedades de los cultivos causadas por potyvirids requiere investigación para desarrollar estrategias de control eficientes. Entre otras, las interacciones moleculares entre virus e insectos vectores son de gran relevancia a efectos de reducir la dispersión del virus47. Aquí determinamos la estructura de los viriones de dos miembros diferentes de Potyviridae utilizando VLP que contienen ARN producidos por un vector viral replicante basado en PVX37. Esta tecnología nos permitió explorar las estructuras del potyvirus SPFMV y el ipomovirus SPMMV, infectando al mismo huésped pero pertenecientes a géneros transmitidos por diferentes insectos vectores.

Los modelos atómicos derivados confirmaron el ensamblaje de filamentos helicoidales que se asemejan a estructuras publicadas previamente de viriones de potyvirus21,22,23. De acuerdo con publicaciones anteriores, ambos tipos de VLP contenían andamios de ARN derivados de vectores para la formación de partículas37,48. Bajo ciertas condiciones, investigaciones publicadas previamente mostraron que las CP de algunos potyvirids eran capaces de autoensamblarse aparentemente en ausencia de ARN49,50 y, de hecho, se han producido diferentes VLP de potyvirus y potexvirus sin ARN22,51,52,53. No obstante, en algunos casos, como PVY, la ausencia de ARN comprometió la simetría helicoidal precisa, lo que resultó en filamentos de anillos apilados, lo que revela nuevamente el papel crucial del ARN para garantizar el ensamblaje adecuado del virión22. De manera similar, las VLP de TuMV que carecían de ARN eran menos estables y altamente heterogéneas en comparación con los viriones de tipo salvaje, con detalles estructurales deficientes que impedían la construcción de un modelo atómico preciso23. Además, en comparación con el rendimiento informado de VLP de TuMV vacías (alrededor de 10 μg/g)52, nuestro sistema mediado por pEff generó mayores rendimientos de VLP, que van de 4 a >30 veces respectivamente para SPFMV y SPMMV, lo que sugiere que la producción de VLP fue efectivamente facilitado. Las observaciones sobre la distribución de las longitudes de VLP no se ajustan exactamente a los tamaños esperados de los ARN más abundantes derivados de las construcciones del vector pEff replicativo. En otros casos, las equivalencias predichas fueron más evidentes, como se encontró con el tobamovirus TMV41 y con el potexvirus AltMV37, lo que sugiere que para los potyvirids de batata, la encapsidación de RNA en VLP estaba regulada de manera menos estricta. Alternativamente, no podemos excluir la posibilidad de que las condiciones requeridas para la purificación puedan resultar en una ruptura parcial de las VLP debido a las fuerzas de corte.

A pesar de pertenecer a la misma familia y compartir una organización estructural similar, las partículas SPFMV y SPMMV presentaron una clara divergencia en términos de estabilidad, como lo reflejan sus propiedades durante los procesos de purificación. Mientras que las VLP de SPFMV se purificaron fácilmente y mantuvieron su integridad durante el almacenamiento prolongado a bajas temperaturas (4 °C), este no fue el caso de las VLP de SPFMV, donde las partículas aparentemente se desarmaron y/o degradaron con facilidad, lo que probablemente contribuyó a una purificación mucho más deficiente. rendimientos Sin embargo, es posible que las diferencias en las propiedades de agregación puedan resultar en pérdidas durante las primeras etapas de purificación. Cuando se sometieron a fluorimetría de barrido diferencial para analizar la estabilidad térmica, los dos tipos de VLP exhibieron diferencias medibles, siendo las VLP de SPFMV menos estables que las de SPMMV, ya que se disociaron a temperaturas más bajas. Además, también se observaron diferencias en los segundos cambios térmicos, probablemente correspondientes a la desnaturalización de los CP monoméricos. Investigaciones recientes están revelando la importancia de las características estructurales, como la estabilidad y la dinámica de los viriones, en relación con funciones biológicamente relevantes de diferentes virus54.

Con respecto a la integridad de las CP, se sabe que las peptidasas vegetales endógenas son responsables de la susceptibilidad de la región N-terminal de muchas CP potyvirales a la escisión proteolítica55. Confirmamos la presencia ocasional de productos relacionados con CP con movilidades más rápidas en SDS-PAGE que las esperadas para CP intactas (Fig. 4 complementaria). Para minimizar el daño, se incorporó un cóctel inhibidor de proteasa a nuestros protocolos de purificación. Sin embargo, a pesar de reducir la degradación proteolítica de CP, este tratamiento no modificó los rendimientos de VLPs, que para SPFMV siempre se mantuvieron por debajo de los de SPMMV, probablemente reflejando otras diferencias estructurales. Nuevamente, la solubilidad intrínseca con menos agregación podría ayudar a explicar los rendimientos consistentemente más altos obtenidos para las VLP de SPMMV.

Nuestros datos sugieren que las partículas de SPFMV son más frágiles que las de SPMMV. Esto podría influir en su especificidad de vector (pulgón y mosca blanca, respectivamente)18,56 aunque serían necesarios más estudios para confirmarlo.

El análisis computacional ha clasificado a la CP potyviral como una de las proteínas más intrínsecamente desordenadas entre los productos génicos codificados por virus57, una característica probablemente relacionada con su versatilidad funcional, que permite múltiples interacciones con otros factores virales, del huésped o del vector13. Nuestros datos crioEM revelaron una gran similitud entre las estructuras atómicas de SPFMV y SPMMV, adoptando una arquitectura similar en comparación con otros poty y potexvirus21,22,23,46,58; sin embargo, en prácticamente todas las estructuras disponibles, no se pudieron rastrear los primeros residuos N-terminales (en este estudio, 90 aa para SPFMV y 65 aa para SPMMV). El extremo N comprende la región más variable dentro de las PC potyvirales, donde hay un motivo DAG conservado relacionado con la transmisión de virus mediada por áfidos, con la ayuda de HCPro14,16. Por otro lado, hasta la fecha no se han identificado motivos específicos ni receptores de vectores que den cuenta de la transmisión de ipomovirus por B. tabaci, aunque investigaciones recientes sobre el análisis mutacional de CP de un clon de CVYV mostraron una clara implicación de la proteína N-terminal en la transmisibilidad de la mosca blanca59. Teniendo en cuenta las dificultades en la transmisión experimental de SPMMV por B. tabaci28,60, sería particularmente interesante explorar más a fondo la implicación de CP durante este proceso. Es tentador considerar que la predicción de alta confianza de AlphaFold de una sección estructurada cerca del N-terminal de SPMMV CP podría ser relevante para la transmisibilidad y/u otras funciones virales. En esta línea, las predicciones de CP de otros ipomovirus también dieron como resultado la identificación de elementos estructurales distintivos cerca del N-terminal, una característica conservada que podría desempeñar un papel en el proceso de transmisión: se necesitará más experimentación para confirmar esa hipótesis.

En contraste con la región N-terminal altamente variable, la región del núcleo central de la proteína de cubierta está bien conservada61, mostrando un patrón común entre muchos otros virus filamentosos, algunos incluso pertenecientes a familias lejanamente relacionadas que infectan animales46,62. La resolución estructural completa del núcleo de CP para ambos virus nos permitió determinar las características comunes con otros potyvirus, incluida la posición de tres residuos clave (Arg, Ser y Asp) aparentemente responsables de la unión del ARN en el bolsillo predicho que abarca cinco nucleótidos de ARN. en nuestras estructuras (Fig. 6) y conservada en otras CP potivirales21,22,23. En particular, estos tres aminoácidos están presentes en posiciones equivalentes tanto en las CP del potyvirus como en el ipomovirus, lo que sugiere que el bolsillo de unión al ARN no se limita a los potyvirus, sino que es una característica compartida entre los potyvirids. Estos residuos conservados también podrían desempeñar funciones clave durante el proceso de ensamblaje de las VLP63,64. En resumen, la interacción de ARN y CP en potyvirids parece estar bastante conservada, convirtiéndose en un objetivo atractivo para los medicamentos antivirales que podrían interrumpir la formación de viriones.

Los mapas de densidad de ambas VLP de batata permitieron mapear casi el extremo C-terminal de CP, solo faltaron los últimos 6 y 9 aa para SPFMV y SPMMV, respectivamente. En ambas partículas, el extremo C-terminal apareció dentro de la luz viral, una observación que contrasta con los modelos predictivos anteriores basados ​​en la inmunogenicidad y los tratamientos proteolíticos con tripsina que proponían que las regiones tanto N-terminal como C-terminal de las CP potivirales estaban expuestas en la superficie65. Sin embargo, todos los datos estructurales recientes han demostrado que el plegamiento de las CP potyvirales da como resultado que la región C-terminal se ubique en la superficie interna como un tubo donde podrían tener acceso moléculas de ciertos tamaños22. Nuestros resultados concuerdan totalmente con estos datos, con un diámetro interno de alrededor de 40 Å. Hablando topológicamente, si el tubo interno es accesible a las proteasas, entonces la región C-terminal puede quedar expuesta, aunque la diferencia con los modelos anteriores65 será la ubicación externa/interna de los extremos N y C. La participación de los brazos distales de CP (N- y C-) en la estructura del virión se ha abordado para las VLP de TuMV vacías, lo que demuestra que las deleciones que afectan las protuberancias N-terminales o las regiones distales C-terminales no interfieren con la acumulación de CP o Montaje de VLP. Esto sugiere que estas partes podrían ser prescindibles durante la formación de partículas66. El mismo estudio propuso un papel directo del dominio C-terminal en la determinación de la longitud de las partículas; sin embargo, esto no se aplica a las VLP de PVY, lo que refleja posibles diferencias entre las especies de potyvirus en esa región concreta22.

En general, en las estructuras de SPFMV y SPMMV, la polimerización de CP parece estar facilitada por las conexiones axiales y de lado a lado de la parte N-terminal de cada subunidad de CP, una característica que parece universal para los miembros de Potyviridae21,22,23 pero difiere para los miembros de Potexvirus , donde solo los CP adyacentes parecen interactuar45,46, lo que probablemente sugiere una estructura menos compacta y estable para las especies de Alphaflexiviridae.

Nuestro estudio aporta estructuras novedosas de dos potyvirids de la batata del género Potyvirus transmitido por áfidos y el género Ipomovirus transmitido por mosca blanca. Las estructuras permiten una comparación directa de la organización de la proteína de la cubierta y el ARN unido, características estructurales que son clave para la infectividad y la movilidad del virus. Además de proporcionar una base para futuras investigaciones de patógenos virales en este importante cultivo, nuestro trabajo también permite comparaciones de viriones transmitidos por dos insectos vectores diferentes. Esto podría ayudar en el desarrollo de medidas de control mejor adaptadas contra las enfermedades virales de la batata con diferente especificidad de vector. Además, la producción de VLP flexibles podría ser potencialmente útil en nanobiotecnología67,68.

El objetivo de nuestro trabajo fue producir VLP de dos virus que infectan la batata para ayudar a resolver sus estructuras, clonando los productos génicos correspondientes en los sistemas de expresión basados ​​en pEff. Los aislados de virus SPFMV9 y SPMMV36 estaban disponibles en nuestro laboratorio. Se usaron hojas de I. batatas infectadas con SPFMV y de N. tabacum infectadas con SPMMV para extraer el ARN total con el reactivo TRIzol (InvitrogenTM) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La amplificación de SPFMV-CP (GeneBank: KU511268) y SPMMV-CP (GeneBank: GQ353374) se realizó con polimerasa de alta fidelidad Phusion (Thermo ScientificTM) después de la transcripción inversa con MultiScribeTM (InvitrogenTM, Thermo Fisher Scientific) y cebadores específicos (enumerados en Complementario Tabla 4). Durante las amplificaciones, los codones de inicio (ATG) y los sitios de restricción AscI se incorporaron aguas arriba de los genes CP, y también los codones de terminación (TGA) y los sitios de restricción XmaI se agregaron aguas abajo. Esta estrategia69 permitió la clonación de CP en el vector de expresión pEff-GFP mediante digestión con enzimas de restricción y ADN ligasa T4 (Thermo ScientificTM). Los plásmidos pEff-SPFMV-CP y pEff-SPFMV-CP derivados se seleccionaron después de la transformación por choque térmico de Escherichia coli (cepa Top10) y la purificación con el kit GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo ScientificTM). Las construcciones de plásmidos se confirmaron mediante secuenciación capilar de Sanger.

Una vez transformadas en A. tumefaciens (cepa LBA4404), las construcciones de plásmido se infiltraron en N. benthamiana siguiendo las técnicas descritas anteriormente70,71,72. Se tomaron muestras de hojas infiltradas a los 3, 5 y 7 días después de la agroinfiltración, y la expresión de CP se confirmó mediante análisis de transferencia Western después de triturar 2 discos de hoja (~60 mm de diámetro) de tejido infiltrado en un disruptor TissueLyser II (QIAGEN, Hilden, Alemania), homogeneizando en 200 μl de tampón de extracción (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM, ácido etilendiaminotetraacético 1 mM, NP-40 al 0,5 % (v/v), β- 2 % (v/v) mercaptoetanol). Las alícuotas clarificadas del sobrenadante después de la centrifugación (8000 × g) durante 10 min a 4 °C se calentaron durante 5 min a 95 °C con tampón de carga Laemmli 4x (250 mM Tris-HCl, pH 7,5, 40 % (v/v) glicerol, SDS al 8 % (p/v) y β-mercaptoetanol al 20 % (v/v)) y sometidos a electroforesis en un gel de poliacrilamida al 12 % con tampón de funcionamiento 1× (tampón Tris-Glicina 10×: Glicina: 1,92 M; Tris : 0,25 M; SDS 1%). Se usó InstantBlue (Abcam, Cambridge, Reino Unido) para la tinción de gel y la cuantificación de proteína total. Para la detección de CP por transferencia Western, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Amersham, GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido), se incubaron primero con anti-SPFMV-CP policlonal o anti-SPMMV-CP (RT-0898 y RT-0900). respectivamente, DMSZ, Braunschweig, Alemania), seguido de anticuerpo secundario de peróxido de rábano picante (HRP) anti-conejo de cabra (Cat. 31460, InvitrogenTM, Thermo Fischer Scientific), y finalmente revelado con sustrato de quimioluminiscencia (SuperSignalTM West Femto, Thermo Fischer Scientific) en un Sistema de imágenes ChemiDocTM (BioRad Laboratories, Hercules, EE. UU.).

El tejido infiltrado se usó fresco o congelado en nitrógeno líquido. Para pEff-SPFMV-CP, la homogeneización se realizó en borato de sodio 100 mM, pH 7,95, seguida de centrifugación a baja velocidad (8000 × g) durante 15 minutos a 4 °C, y el sobrenadante se analizó después de la tinción negativa en microscopía electrónica de transmisión (TEM). ) para visualizar partículas ensambladas (ver detalles a continuación). De manera similar, para pEff-SPMMV-CP, el tejido infiltrado se homogeneizó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,2 y se detectaron partículas en el sobrenadante derivado después de una centrifugación a baja velocidad (12 000 × g) durante 15 min a 4 °C.

La purificación de SPFMV-VLP se basó en el protocolo establecido por Nakashima y colegas para la purificación de viriones40, con varias modificaciones. El tejido infiltrado de N. benthamiana se cosechó 7 días después de la agroinfiltración, se congeló y homogeneizó en un mezclador Waring de laboratorio (Waring Lab, Torrington, EE. UU.) con 3 volúmenes de tampón de extracción #1 (tampón Hepes 50 mM, urea 500 mM, EDTA , Na2SO3 al 0,5%, pH 8), que contiene Mini Complete™ EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania), tratando de minimizar la degradación por la actividad de la proteasa. El homogeneizado se filtró a través de 2 capas de Miracloth (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) y se aclaró mediante centrifugación a baja velocidad (8000 × g) durante 10 min a 4 °C, y el sobrenadante se agitó durante 1 h con Triton X al 2 %. -100 (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) a 4 °C. Después de una segunda clarificación mediante centrifugación a baja velocidad (8000 × g, 10 min, 4 °C), el sobrenadante se depositó en la parte superior de un cojín de sacarosa al 20 % (p/v) en el tampón de extracción n.º 2 (tampón Hepes 20 mM, Urea 250 mM, EDTA 10 mM, pH 7,2) y centrifugado a 130 000 × g durante 2,5 h a 4 °C en un rotor SureSpin 630 de cubeta oscilante (Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.). Los sedimentos se resuspendieron durante la noche en tampón de extracción n.º 3 (tampón Hepes 10 mM, urea 50 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2). Después de la clarificación a 2000 × g durante 10 minutos a 4 °C, el sobrenadante se cargó en un gradiente de sacarosa al 10 %-40 % p/v en el tampón de extracción n.º 3 y se sometió a ultracentrifugación a 90 000 × g durante 2 h a 4 °C. en un balde oscilante AH-650 Rotor (Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.). Se recogieron fracciones de 500 μl y se analizaron sus contenidos en un gel SDS-PAGE al 12 %, se tiñeron con InstantBlue (Abcam, Cambridge, Reino Unido) y también se observaron con imágenes TEM. Para los estudios crioEM, las fracciones con mayor concentración de VLP se agruparon y el exceso de sal se eliminó utilizando columnas de desalinización PD-10 (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido) equilibradas con el tampón de extracción n.º 3 y se concentraron aún más girando a 103 000 × g 1 h a 4 °C en Rotor AH-650. El sedimento se resuspendió en el tampón de extracción n.° 3, se clarificó a 8000 × g durante 5 min y el sobrenadante resultante se usó para todos los análisis posteriores, incluido cryoEM.

La purificación de partículas similares a virus SPMMV se basó en protocolos previamente descritos28 con modificaciones. El tejido infiltrado de N. benthamiana congelado recolectado 5 días después de la agroinfiltración se homogeneizó en 3 volúmenes de tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7, que contenía 0,1 % de β-mercaptoetanol) y se clarificó a baja velocidad (8000 × g, 15 min, 4 °C). C) antes de haber sido sometido a ultracentrifugación (100 000 × g, 90 min, 4 °C) en un rotor SureSpin 630 de cubeta oscilante (Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.). El sedimento se resuspendió durante la noche en tampón de fosfato, se clarificó (2000 × g, 10 min, 4 °C) y se cargó en un gradiente de sacarosa del 10 al 40 % p/v para ultracentrifugación (100 000 × g, 3 h, 4 °C), en un balde oscilante AH-650 Rotor (Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.). Se recogieron fracciones de 500 μl y se analizaron en un gel SDS-PAGE al 12 %, se tiñeron con InstantBlue (Abcam, Cambridge, Reino Unido) y se tomaron imágenes TEM posteriores. Para los estudios crioEM, las fracciones con el mayor contenido de VLP se agruparon y el exceso de sal se eliminó utilizando la columna de desalinización PD-10 (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido) equilibrada con tampón de fosfato de sodio. Como anteriormente, las muestras se sometieron a cryoEM y otros análisis.

El ARN se extrajo de las VLP utilizando el RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania). Aproximadamente 0,5 μg de ARN extraído se resolvió mediante electroforesis en un gel de agarosa con formaldehído desnaturalizante al 1,5 % (p/v) y se transfirió por capilaridad a una membrana de nitrocelulosa cargada positivamente (Roche, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) utilizando un tampón SSC 10x. Para el análisis de transferencia Northern, las membranas se incubaron con sondas de ARN marcadas con digoxigenina dirigidas a secuencias específicas de interés. Se prepararon tres sondas de ARN diferentes (sonda PVX-RdRp, sonda SPFMV-CP y sonda SPMMV-CP) con el kit de etiquetado de inicio DIG (Roche, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) y utilizando como plantillas fragmentos de PCR que incorporan el T7 secuencia promotora de la transcripción in vitro. La detección se realizó utilizando anticuerpo anti-DIG conjugado con fosfatasa alcalina y la señal fue capturada por un sistema de imágenes ChemiDocTM (BioRad Laboratories, Hercules, EE. UU.) después de aplicar el reactivo de quimioluminiscencia CDP-Star (Roche, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania).

Se utilizó un método basado en el ensayo de fluorimetría diferencial de barrido73 para comparar la estabilidad térmica de las VLP purificadas. Brevemente, se añadió Sypro Orange como fluoróforo extrínseco43,44 a las preparaciones de VLP y se determinaron las lecturas a lo largo de un gradiente de temperaturas en un equipo qPCR Mx3005p en tiempo real (Agilent). Para asegurar la reproducibilidad de los datos, se usaron duplicados para cada muestra en ambos ensayos. Las temperaturas de fusión (Tm) se calcularon después de la normalización de datos utilizando la primera derivada de una fracción nativa para cada muestra para determinar las pendientes máximas en las diferentes secciones de las curvas.

Para la visualización por microscopía electrónica de VLP, las muestras (extractos crudos clarificados o fracciones de VLP purificadas) se aplicaron en rejillas de cobre recubiertas de carbono (EM Resolutions, Sheffield, Reino Unido) y se dejaron absorber durante 1 min, antes de eliminar el exceso con transferencia. papel, y posteriormente teñido con acetato de uranilo al 2% (p/v) por 1 min más. Las imágenes se tomaron con un Talos F200C TEM (Thermo Fischer Scientific, Waltham, EE. UU.) Equipado con una cámara Gatan OneView. Para las pruebas de rutina de las purificaciones realizadas en el laboratorio del CRAG, también se utilizó un microscopio Jeol JEM-1400 (120 kV). Las mediciones de tamaño para determinar la distribución de longitudes de VLP se realizaron en imágenes bien contrastadas mediante la medición de hasta 150 partículas individuales seleccionadas imparcialmente en la imagen siguiendo un itinerario de boustrophedon, calculando parámetros estadísticos con Excel.

Las rejillas CryoEM se prepararon aplicando tres μL de cada muestra a rejillas de carbón perforadas (Quantifoil, 1.2/1.3), se incubaron brevemente en la cámara a 4 °C con 100 % de humedad y se vitrificaron en etano líquido usando un Vitrobot IV (Thermo Fisher Scientific). Luego, las rejillas se transfirieron a un microscopio Titan Krios, operado a 300 keV, equipado con un detector Falcon III para la recopilación de datos. En total, se recolectaron 3276 películas (SPFMV) y 2260 películas (SPMMV), cada película contenía 32 fotogramas con una dosis de ~1e-/A2 por segundo.

Las estadísticas de procesamiento de imágenes se muestran en la Tabla 1. Todos los pasos de procesamiento de imágenes se llevaron a cabo utilizando RELION 3.174, a menos que se indique lo contrario. Para los conjuntos de datos SPFMV y SPMMV, las películas se corrigieron para el movimiento inducido por el haz utilizando la implementación RELION de motioncor275. Las micrografías con corrección de movimiento se estimaron para los parámetros de la función de transferencia de contraste (CTF) utilizando CtfFind476.

Los segmentos helicoidales se seleccionaron utilizando la herramienta de selección de segmentos helicoidales en crYOLO77 basada en el entrenamiento de un modelo utilizando segmentos seleccionados manualmente de un subconjunto de micrografías. El segmento helicoidal seleccionado automáticamente coordinado se importó a relion y se extrajo en un tamaño de cuadro de 208 por 208 píxeles. Los segmentos se extrajeron con una estimación inicial de 8 unidades asimétricas por segmento. Los segmentos extraídos se analizaron utilizando varias rondas de clasificación 2D, utilizando configuraciones helicoidales 2D implementadas en RELION74. Los segmentos con elementos de estructura secundaria visibles en los promedios de clase se seleccionaron para su posterior procesamiento y las clases basura se descartaron. Para el mapa de referencia inicial, se generó un cilindro con el diámetro de los virus usando relion_helix_toolbox y se usó como entrada para la clasificación 3D con una sola clase como salida. Las estimaciones iniciales de los parámetros helicoidales fueron un aumento helicoidal de 4,0 Å y un giro helicoidal de 40°, basados ​​en estructuras anteriores de Potyviridae21,22,23. Luego, el mapa de salida se usó como entrada para una segunda ronda de clasificación 3D, con cinco clases, ejecutando una búsqueda global para la alineación y buscando parámetros helicoidales (manteniendo fijas las inclinaciones previas). Una de las cinco clases proporcionó un mapa 3D donde se observó una separación inequívoca de las subunidades CP. A continuación, este subconjunto de partículas se refinó mediante el refinamiento 3D helicoidal, en busca de giros y aumentos helicoidales locales para refinar los parámetros helicoidales iniciales. Los mapas refinados con resoluciones de 4,8 Å (SPFMV) y 6,5 Å (SPMMV) se usaron luego como entrada para la clasificación 3D sin alineación para separar partículas en función de la precisión del refinamiento. Las partículas mejor refinadas seleccionadas (48 042 segmentos para SPFMV y 30 663 segmentos para SPMMV) se refinaron nuevamente antes de ejecutar el pulido bayesiano y rondas iterativas de refinamiento CTF, lo que resultó en mapas mejorados con resoluciones de 2,6 Å (SPFMV) y 3,0 Å (SPMMV), basado en el criterio estándar de oro FSC 0.143. Los mapas se afilaron con el programa PostProcess en RELION y se evaluó su resolución local con Resmap78. Los mapas enfocados y no enfocados se usaron para la construcción de modelos para las dos estructuras. El flujo de trabajo seguido para el procesamiento de imágenes se resume como material complementario (Fig. 7 complementaria).

Los modelos de homología para SPFMV y SPMMV se generaron utilizando Phyre279 en función de las estructuras existentes en el banco de datos de proteínas (PDB). Las estructuras de CP se ajustaron inicialmente con cuerpo rígido en los mapas de densidad cryoEM utilizando la función 'ajustar en el mapa' en UCSF Chimera80. Según los ajustes preliminares, los modelos para las proteínas de la cubierta se refinaron manualmente en Coot81, agregando residuos de alanina en el lugar para la secuencia WT donde la densidad del mapa EM tenía una resolución insuficiente. En función de la resolución dentro de las regiones de unión al ARN del CP en ambos mapas, se rastrearon cinco nucleótidos del ARN de novo en Coot como una cadena poli-U. Los modelos se sometieron a refinamiento del espacio real en Phenix82, junto con ISOLDE83 para corregir los valores atípicos de la geometría del modelo. En cada ronda de refinamiento, los modelos se inspeccionaron en Coot para verificar si había valores atípicos o conflictos restantes. A continuación, las proteínas de la cubierta se simetrizaron en UCSF Chimera basándose en los parámetros helicoidales determinados empíricamente. Con el fin de mejorar la precisión del modelo en las interfaces entre subunidades, se seleccionaron y refinaron tres subunidades de proteína de cubierta por giro helicoidal mediante el refinamiento de espacio real en Phenix. Los cálculos de la interfaz entre subunidades se realizaron con el servidor PISA84 y los cálculos electrostáticos de los modelos ajustados se realizaron con UCSF Chimera. El programa de validación Phenix se ejecutó en los modelos refinados para evaluar los parámetros geométricos del modelo hasta que no se observaron más mejoras.

Se usaron secuencias completas para SPFMV y SPMMV CP, junto con otras CP de ipomovirus, para la predicción de estructura basada en secuencias utilizando el servidor AlphaFold85. En resumen, los archivos de secuencias de proteínas se proporcionaron como entrada para la predicción de pliegues alfa, ejecutando una alineación de múltiples secuencias y una predicción de estructura secundaria en su red preentrenada. Los modelos con la puntuación más alta se analizaron y colorearon según el factor b o la puntuación P utilizando UCSF ChimeraX. Las figuras se generaron utilizando UCSF ChimeraX.

Las expresiones transitorias de CP y las purificaciones de VLP se realizaron siguiendo los protocolos descritos de forma independiente en dos laboratorios, JIC y CRAG, con resultados reproducibles. Para la determinación de la estructura CryoEM, los parámetros y estadísticas de recopilación de datos, análisis de imágenes y construcción de modelos se muestran en la Tabla 1.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los mapas cryoEM se depositaron en el banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) con los códigos de acceso 8ACB (SPFMV) y 8ACC (SPMMV), y los modelos se depositaron en el banco de datos de proteínas (PDB) con los códigos de acceso EMD-15345 (SPFMV) y EMD- 15346 (SPMMV) respectivamente. Los datos sin procesar de los que se derivaron estos modelos se depositaron en la base de datos EMPIAR como EMPIAR-11490 - SPMMV y EMPIAR-11491 - SPFMV. Los datos de origen para los gráficos de la figura 3 están disponibles como datos complementarios. Las imágenes sin recortar de geles y transferencias se proporcionan en la Fig. 8 complementaria. Otros datos están disponibles de los autores a pedido razonable.

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Agradecemos a las plataformas de Horticultura y Bioimagen del JIC, la instalación central de Crecimiento Vegetal del CRAG y el Servei de Microscòpia UAB, cuyo apoyo fue invaluable a lo largo de este estudio. Se agradece mucho el asesoramiento sobre desplazamiento térmico de Adrián Velázquez Campoy (Instituto Universitario de Investigación de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos, BIFI, Universidad de Zaragoza, España). Agradecemos a Adrian Valli (CNB-CSIC, Madrid, España) por sus útiles debates. Financiación proporcionada por la subvención PID2019-105692RB-100 (a JJLM) y CEX2019-000902-S (otorgada al CRAG), ambas de la Agencia Estatal de Investigación AEI, España, MCIN/AEI/10.13039/501100011033, por Programa CERCA / Generalitat de Catalunya subvención 2018 FI_B 00329 y EMBO Short-Term Fellowship 8695 (to OC), del proyecto EC Horizon 2020 Pharma-Factory 774078, y UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) Grants BB/R001669/1 y BB/T004703/1 ( a GPL), y BB/T004525/1 (a NAR y GPL), y por la Beca del Programa Estratégico del Instituto "Molecules from Nature—Enhanced Research Capacity" BBS/E/J/000PR9794 y la Fundación John Innes.

Mateo J. Byrne

Dirección actual: Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, Fermi Ave, Didcot, Oxfordshire, OX11 0DE, Reino Unido

Centro de investigación en Agricultural Genomics (CRAG, CSIC-IRTA-UAB-UB), 08193, Cerdanyola del Vallès, Barcelona, ​​Spain

Ornela Chase y John José López-Moya

Centro Astbury de Biología Molecular Estructural, Escuela de Biología Molecular y Celular, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Leeds, Leeds, Reino Unido

Abid Javed, Matthew J. Byrne y Neil A. Ranson

Departamento de Bioquímica y Metabolismo, Centro John Innes, Parque de Investigación de Norwich, Norwich, NR4 7UH, Reino Unido

Eva C. Thuenemann y George P. Lomonossoff

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Conceptualización: OC, ECT, GPL, NAR y JJLM Metodología, investigación y visualización: OC, AJ, MJB, ECT, GPL, NAR y JJLM Supervisión: GPL, NAR y JJLM Redacción-borrador original: OC, AJ, GPL, NAR y JJLM Escritura-revisión y edición: OC, AJ, MJB, ECT, GPL, NAR y JJLM

Correspondence to Juan José López-Moya.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Giuseppe Zanotti y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Manidipa Banerjee y David Favero. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Chase, O., Javed, A., Byrne, MJ y col. CryoEM y análisis de estabilidad de partículas similares a virus de potyvirus e ipomovirus que infectan a un huésped común. Comun Biol 6, 433 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04799-x

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Recibido: 17 Octubre 2022

Aceptado: 03 abril 2023

Publicado: 19 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04799-x

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